3.酵母细胞壁的破除：

a.酶法：向菌体中加入 300μl Buffer SE 能，加入大约50μl Lyticase (约50U) ，充分混匀，并在摇床上 220rpm / min , 30℃处理30 min ～1小时。3000 x g离心 5 min，沉淀原生质球，小心弃去上清，收集沉淀。加入 250μl溶液S1 Resuspension Buffer（请先检查是否已加入 RNaseA ) 重悬沉淀。

注意：以上 Lyticase 的用量和处理时间为经验值，根据酵母菌株和酵母细

胞数量的不同，所用 Lyticase 的浓度和孵育时间应该进行适当调整。对于

酵母的不同菌株，孵育时间和酶量有所不同，后续操作裂解的程度取决于原生质球的数量。原生质球. 必须小心操作。

 b.玻璃珠法：向菌体中加入 250μl溶液S1 Resuspension Buffer（请先检查是否已加入 RNaseA ) 重悬沉淀，彻底悬浮菌体。加入 0.1g 直径为0.45～0.55mm 的酸洗玻璃珠，涡旋振荡 10 分钟。让玻璃珠自然下沉，转移裂解液至一个新离心管.

.8.  碱裂解  将250μl溶液S2 Lysis Buffer  加入细菌重悬液，温和地上下翻转混合6～10次。

    注意：此步请轻柔混合，剧烈混合如Vortex会导致基因组DNA断裂，从而污染质粒DNA。碱裂解不宜超过5分钟，否则会导致部分质粒DNA不可逆变性。

9.  中和  加入350μl溶液S3 Neutralization Buffer,立即轻柔地上下翻转混合直至蓝色彻底消失。室温放置5分钟。室温12000rpm离心10分钟。

10. 柱结合  将上述操作的上清液转移至吸附柱Spin Column中，13000rpm离心1分钟，弃滤液。

11. 漂洗  将700μl的漂洗缓冲液 Wash Buffer加入吸附柱Spin Column中，12000rpm离心30-60秒，弃滤液。

12. 再漂洗  将500μl的漂洗缓冲液 Wash Buffer加入Spin Column中，12000rpm离心30-60秒，弃滤液。 空柱12000rpm再离心2分钟，除去残留乙醇。

13. 洗脱  将Spin Column按置于新的洁净的1.5ml的离心管上，在吸附柱Spin Column膜的中央处加入30～100μl的水或洗脱缓冲液Elution Buffer，室温静置1分钟，12000rpm离心1分钟洗脱DNA，可立即用于下游分子生物学实验或-20℃保存。

注意：Elution Buffer 组成为2.5mM Tris-HCI (pH8.5),不影响测序和酶切反应，。把水或洗脱液加热于60℃使用时有利于提高洗脱液效率，如果提取的质粒>10kb，请将洗脱液预热至60℃，并适当延长洗脱时间。

质粒DNA浓度和纯度检测

   OD260值为1，相当于50ug/ml的双链DNA。也可以通过DNA Marker通过琼脂糖凝胶电泳半定量。

OD260/ OD280比值一般为1.7-1.8，如果洗脱时不使用缓冲液，而使用去离子水，由于受PH值和离子浓度的影响，比值会偏低。