5)从悬浮细胞中提取病毒RNA:可直接离心收集细胞,每400ul Buffer RN1可裂解5×10
6动物、植物或酵母细胞,或10
7细菌细胞(需要特殊处理的细胞如植物、酵母等等参照本公司相应试剂盒)。混合均匀, 冰浴5 min
3. 加入400ul Buffer RN2,振荡混匀,大约 12,000×g 离心10 min。
* 4℃条件下离心。
4. 取上清至1.5 ml离心管中,加入0.6体积的异丙醇(或加入1体积无水乙醇),混合均匀。
步骤5-9可选择硅胶膜吸附法或离心沉淀法:
* 硅胶膜吸附法与离心沉淀法相比,前者更纯净,而后者提取量大,如病毒拷贝较少时,可采用后者。
A. 硅胶膜吸附法
5A. 将制备管置于2 ml (试剂盒内提供) 离心管中,转移步骤4中的混合液到制备管中,6,000×g离心1min。
* 4℃条件下离心。
6A. 弃滤液,将制备管弃滤液,将制备管置回到2 ml离心管中,制备管中加入700 μl Buffer RW1,12,000×g离心1 min。
* 确认在Buffer中已按试剂瓶上指定的体积加入无水乙醇。
7A. 弃滤液,将制备管置回到2 ml离心管中,在制备管中加入700 μl Buffer RW2,12,000×g离心1 min;以同样的方法再用500μl Buffer RW2洗涤一次。
* 确认在Buffer W2 concentrate中已按试剂瓶上指定的体积加入无水乙醇。
8A. 弃滤液,将制备管置回到2 ml离心管中,12,000×g离心3 min。
9A. 将制备管放入干净RNase-free的1.5 ml离心管中,在制备管膜中央加30-100 μl Buffer RT(RNase-free) 。室温静置1 min,12,000×g离心1 min,洗脱得RNA
B. 离心沉淀法
5B. 12,000×g离心10 min,尽量弃去上清。
6B. 加入700 μl Buffer RW1,2,000×g离心5 min。
* 确认在Buffer Buffer RW1中已按试剂瓶上指定的体积加入无水乙醇。
7B. 弃去管中溶液,加入700 μl Buffer RW2,2,000×g离心5 min。重复一次。
* 确认在Buffer W2 concentrate中已按试剂瓶上指定的体积加入无水乙醇。
8B. 弃去管中溶液,自然干燥。
9B. 加入10-100 μlBuffer RT (RNase-free) ,溶解RNA。
RNA定量及纯度检测
总RNA 的定量和定性分析: 所有标本均经紫外分光光度仪检测所提取总RNA 的浓度及纯度,OD260/OD280 的值为1.7~ 2.0。